本試劑盒僅供體外研究使用
預期應(yīng)用
ELISA法定量測定小鼠血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中高密度脂蛋白(HDL)含量。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗HDL抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗HDL抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的HDL呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板:一塊(96孔)
1. 標準品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為5 mmol/L,做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋)后,分別稀釋5 mmol/L,2.5 mmol/L,1.25 mmol/L,0.625 mmol/L,0.312 mmol/L,0.156 mmol/L,0.078 mmol/L,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 mmol/L,臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制2.5 mmol/L標準品:取0.5ml(不要少于0.5ml)5 mmol/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
2. 樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
3. 檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。
4. 檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。
5. 檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。
6. 檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
7. 底物溶液:1×10ml/瓶。
8. 濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
9. 終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
10. 覆膜:1×5張
標本的采集及保存
1. 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復凍融。
2. 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復凍融。
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復凍融。
注:以上標本置4℃保存應(yīng)小于1周,-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,-20℃不應(yīng)超過3個月,-80℃不應(yīng)超過6個月;標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測;高血脂的標本不需進行特殊處理,可直接檢測。
操作步驟
實驗開始前,請?zhí)崆芭渲坪盟性噭辉噭┗驑悠废♂寱r,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時,均應(yīng)用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預實驗以建立*稀釋倍數(shù)。
1. 加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
4. 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,37℃,60分鐘。
5. 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
7. 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng),此時藍色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進行檢測。
注:
1. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔),該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。
3. 洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。
4. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。
5. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
6. 未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,請配置標準品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10ul),以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差;檢測液A、B,以及底物溶液在使用前,應(yīng)置于37℃溫育30分鐘;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
7. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需
要,重復此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠高密度脂蛋白(HDL),且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,如curve expert 1.3),根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。
3. 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。
4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5. 在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
6. 底物請避光保存。
7.
檢測范圍:0.078 mmol/L - 5 mmol/L
zui低檢測限:0.02 mmol/L
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品,酶結(jié)合物或底物時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的 “預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。
3. 試劑盒保存:短期(2周以內(nèi))以標簽上的標示為準,長期保存請將試劑全部保存于-20℃。
4. 濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正常現(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。
7. 所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期:6個月
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